南京英瀚斯(圖)-*編輯技術-榆林細胞

關于細胞凍存的注意事項：
1. 為保持細胞大存活率，一般都采用慢凍存融的方法。
2. 凍存物距液氮面越近溫度越低。標準的低凍速度為－1℃~12℃/ 分鐘，當溫度下降達－25℃時，下降速度可增至－5~－10℃/ 分鐘，到－100℃時則可迅速凍入液氮中。因此要適當掌握凍存物下降入液氮中的速度，過快能影響細胞內水分透出，太慢則促冰晶形成。
3. 初次凍存者在下降凍存時，宜先用細木棒伸入罐中探測液面位置，然后需用溫度計與凍存物并行的辦法，以觀測下降凍存物的速度、凍存物與液氮液面距離和溫度三者關系，當已掌握以上各參數和凍存技術熟練后，僅按下降時間和下降距離便可獲理想凍存效果。
細胞實驗介紹——流式細胞術檢測細胞周期和凋亡
流式細胞術檢測細胞周期：
細胞周期：指細胞從*次分裂結束起到下一次分裂結束為止的活動過程，通常由g0/g1期、s期、g2期和m期組成。g0/g1期：有絲分裂發生，細胞分裂成兩個細胞，進入下一個細胞周期，或者進入靜止期（g0期），而g0期從dna含量上無法與g1期區分，細胞開始rna和蛋白質的合成，但dna含量仍保持二倍體。s期：dna開始合成，細胞培養，細胞核內dna的含量介于g1期和g2期之間。g2期和m期：當dna成為4倍體時，細胞進入g2期。g2期細胞繼續合成rna及蛋白質，直到進入m期。
pi法是經典的周期檢測方法。pi為插入性核酸熒光染料，榆林細胞，能選擇性的嵌入核酸dna和rna雙鏈螺旋的堿基之間與之結合，其結合的量與dna的含量成正比例關系，用流式細胞儀進行分析，就可以得到細胞周期各個階段的dna分布狀態，從而計算出各個期的百分含量。
一般流程：細胞收集-70%酒精固定過夜-pi染色-流式細胞儀檢測。
細胞凋亡：細胞凋亡的早期就有細胞膜表面*損發生。*損時凋亡細胞表面的磷脂腺絲氨酸(ps)可以從細胞內膜翻轉至細胞的外膜。該過程發生在之前，檢測ps的表達，能反映早期凋亡。annexinv是ca2 依賴的磷脂結合蛋白，對ps有很高的親和性，并且可以與暴露于細胞外的ps相結合。利用這一原理，可以將annexinv標記熒光來識別早期的細胞凋亡。通常利用annexinv-fitc和碘化丙啶(pi)來區分凋亡和壞死細胞。pi的膜通透性很差，因而只能標記壞死的細胞。
一般流程：細胞收集-pi-annexinv標記-流式細胞儀檢測。
結果示例：
圖 a 細胞周期檢測圖；b 細胞凋亡檢測圖
二、脂質體轉染操作步驟1、操作步驟 [方法一]：
(1) 細胞培養：取 6 孔培養板 (或用 35 mm 培養皿)，向每孔中加入 2 ml 含 1～2×105 個細胞培養液，37℃ co2 培養至 40%～60% 匯合時 (匯合過分，轉染后不利篩選細胞)。
(2) 轉染液制備：在聚苯乙稀管中制備以下兩液 (為轉染每一個孔細胞所用的量)a 液：用不含培養基稀釋 1-10 μg dna，終量 100μl，b 液：用不含培養基稀釋 2-50 μglr，*編輯技術，終量 100μl，輕輕混合 a、b 液，室溫中置 10-15 分鐘，稍后會出現微濁現象，但并不妨礙轉染 (如出現沉淀可能因 lr 或 dna 濃度過高所致，應酌情減量)。
(3) 轉染準備：用 2 ml 不含培養液*洗兩次，293t細胞，再加入 1 ml 不含培養液。
(4) 轉染：把 a/b 復合物緩緩加入培養液中，搖勻，37℃ 溫箱置 6～24 小時，吸除無轉染液，換入正常培養液繼續培養。
(5) 其余處理如觀察、篩選、檢測等與其它轉染法相同。
注意：轉染時切勿加，對轉染效率有很大影響。
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